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descriptionTD 5 de Microbiologie Oran IGMO : Les tests biochimiques d’identification

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TD 5 de Microbiologie Oran IGMO : Les tests biochimiques d’identification

Par  Messaoui Naima

Identification biochimique:
 L'identification biochimique est un examen qui permet d'identifier une bactérie en s'appuyant sur ces caractères biochimiques, voici les caractères biochimiques qu’on cherche souvent chez les bactéries :
A- l’étude des enzymes respiratoires terminales
A1- Recherche de l’oxydase
A2- Recherche de la catalase
B-Etude des caractères biochimiques
B1- Le métabolisme glucidique
B2- Étude des différentes voies fermentatives intermédiaires
B2-1. Réaction au rouge de méthyle
B-2. 2. Réaction de Voges-Proskauer (Production d’acétoïne
B-2. 3. Production du gaz à partir du glucose
B- 2. 4. Recherche deβ-galactosidase
B- 2. 5. Métabolisme des composés azoté
B- 2. 5. 1. Recherche de nitrate réductase
B- 2. 5. 2. Recherche de l’uréase
B-2. 5. 3. Métabolisme protéique
B-2. 5. 3. 1. Recherche des décarboxylases : Lysine décarboxylase (LDC), Ornithinedécarboxylase (ODC) et Arginine dihydrolase (ADH)
B-2. 5. 3. 2. Recherche du tryptophane désaminase (TDA)
B-2. 5. 3. 4. Production d’indole
B-2. 6. Métabolisme des molécules larges
B-2. 6. 1. Recherche de lécithinase
B-2. 6. 2. Recherche de lipase
B-2. 6. 3. Recherche d’α-amylases
B-2. 6. 4. Recherche des protéases
B-2. 6. 4. 1. Recherche de la caséinase
B-2. 6. 4. 2. Recherche de la gélatinase
B-2. 6. 5. Recherche de citrate perméase
B-2. 7. Autres tests
B-2. 7. 1. Utilisation du mannitol
B-2. 7. 2. Recherche d’hémolysines
B-2. 7. 3. L’antibiogramme
B-2. 7. 4. Systèmes d’identifications microbiennes commerciales : La galerie Api 20E B-2. 7. 5. Croissance sur milieu King (King A et King B)
 
 
 
 
A retenir
Test Oxydase = Test d'ONPG :
Ce test permet de rechercher la présence d'une enzyme intracellulaire â-galactosidase (ONPG hydrolase) qui permet l'hydrolyse du lactose en glucose et galactose.
 


Une bactérie lactose- peut l'être pour 2 raisons :
·Absence de â-galactosidase.
·Absence de â-galactoside perméase
Le test ONPG permet de recherche directement la présence de â-galactosidase en fournissant à la bactérie un substrat de cette enzyme : L'orthonitrophényl- â-D-galactopyranoside.
Test catalase :
La catalase est un enzyme ayant la propriété de décomposer le peroxyde d'hydrogène (H2O2)avec dégagement d'oxygène selon la réaction suivante :

2H2O2 catalase 2H2O + O2
Technique:
Sur une lame et à l’aide d’une pipette Pasteur, on dépose une colonie bactérienne à laquelle onajoute de l'eau oxygénée (à 10 volumes).
Lecture:
Catalase+ : effervescence.Catalase - : pas d'effervescence.
 
 
Milieu BCPL :
Le milieu BCP ou bouillon lactosé au BCP est un milieu de culture non sélectif et non enrichi utilisé en microbiologie pour l'identification de bactéries. C'est un milieu différentiel, comportant un indicateur de pH, le pourpre de bromocrésol (BCP de l'anglais « bromocresol purple »). Ce dernier donne une couleur pourpre au milieu, et passe au jaune si le lactose du milieu est utilisé par les bactéries, par fermentation.
Lecture
Le pourpre de bromocrésol est pourpre en milieu basique ou neutre, et devient jaune lorsque le milieu devient acide et que le pH diminue.
    Les bactéries "lactose +" utilisent le lactose présent dans le milieu comme source d'énergie. En dégradant le lactose, les bactéries produisent de l'acide ce qui entrainera une acidification du milieu et donc le virage de l'indicateur coloré de pH (le pourpre de bromocrésol), qui en milieu acide est jaune.
    les bactéries "lactose -" n'utilisent pas le lactose mais les peptones. En dégradant les peptones les bactéries alcalinisent le milieu qui restera donc violet.
Milieu Kligler-Hajna
Le milieu de Kligler-Hajna est un milieu de culture permettant la recherche simultanée de :
    L'utilisation du lactose ;
    La fermentation du glucose ;
    La production d'H2S ;
    La production de gaz ;
    La lysine décarboxylase.
    La B-galactosidase pour les bactéries lactose - (test ONPG)
Ensemencement
    La pente doit être abondamment ensemencée (stries serrées).
    Le culot est ensemencé par simple piqûre.
Incubation : 37 °C pendant 18 à 24 h (ne pas dépasser ce délai) après avoir dévissé le bouchon partiellement ce qui permet les échanges gazeux.
Pour pouvoir utiliser le lactose, une bactérie doit posséder deux enzymes (schéma ci-contre) :

  • Une β-galactoside perméase (1) ;
  • Une β-galactosidase (2) .

Il s'ensuit une série de réactions de dégradation du glucose (3) conduisant à la production d'énergie E.
Le glucose inhibe la synthèse de ces deux enzymes. C'est ce que l'on appelle l'effet glucose. En effet, l'utilisation des glucides suit la loi de diauxie, l'utilisation du lactose n'aura lieu qu'après épuisement du glucose. Or, le glucose est en faible quantité par rapport au lactose et la pente est ensemencée abondamment.
La pente et le culot doivent être interprétés indépendamment.

Figure 1 : Résultats de l'incubation du milieu de Kligler-Hajna.
Interprétation de la pente

  • Dans un premier temps, les bactéries utilisent le glucose comme source de carbone et d'énergie (à cause de l'effet glucose). Cette utilisation s'accompagne de la production d'acides organiques d'où le virage du rouge au jaune du milieu (figure A).
  • Dans un second temps, du fait du développement rapide (en aérobiose) et de la faible concentration en glucose en moins de 24 heures, la totalité du glucose est dégradé, il y a disparition de l'effet glucose. Puis, deux possibilités :

    • Si la bactérie est β-galactoside perméase + ET β-galactosidase + : les bactéries utilisent le lactose avec production d'acides organiques : le virage au jaune est confirmé (figure B).
    • Si la bactérie est β-galactoside perméase + et β-galactosidase - OU β-galactoside perméase - et β-galactosidase - : les bactéries ne peuvent pas utiliser le lactose. Les bactéries utilisent alors comme source de carbone et d'énergie les peptones (qui ne sont dégradables qu'en conditions aérobies) : le métabolisme protique libère des produits basiques (ammoniac, amines...) d'où une recoloration au rouge de la pente.



Ainsi :

  • Pente rouge : bactérie lactose 


Interprétation du culot

  • Dans un premier temps, les bactéries fermentent le glucose avec production importante d'acides organiques (à cause de l'effet glucose)
  • Comme sur la pente, en moins de 24 heures, tout le glucose est fermenté. Cependant, si les bactéries sont lactose -, l'utilisation des peptones avec une alcalinisation ne permet pas le revirage de l'indicateur de pH, le culot restera jaune en 24 h (figure D).
  • Si la bactérie n'est pas capable de fermenter le glucose, il n'y a pas production d'acides organiques, le culot reste rouge (figure C).

Ainsi :

  • Culot rouge : bactérie glucose -
  • Culot jaune : bactérie glucose


Production de gaz
La production de gaz lors de l'utilisation des glucides est mise en évidence par le décollement de la gélose et/ou des bulles dans la gélose. (On parle aussi de « fragmentation » de la gélose). S'il n'y a pas ces témoins de dégagement gazeux, la bactérie est gaz
Production de sulfure d'hydrogène
Elle a lieu à partir de l'ion thiosulfate :
Le sulfure d'hydrogène réagit avec les ions fer III (Fe3+) du citrate de fer pour former un précipité de sulfure de fer noir. Ainsi :

  • Bactéries H2S + : précipité noir ;
  • Bactéries H2S - : pas de précipité noir.

 
 
 
 
 
La galerie Api 20 E:
 
La galerie API 20E compote 20 microtubes contenant des substrats sous forme déshydratée, Les tests sont inoculés avec une suspension bactérienne qui reconstitue les milieux. Les réactions produites pendant la période d'incubation se traduisent par des virages colorés spontanées ou révélés par l'addition de réactifs
Une galerie API est un ensemble de petits tubes prêts à l’emploi permettant l'identification de micro-organismes par la réalisation rapide et facile de tests biochimiques miniaturisés


Identification par galerie API Les galeries Api utilisent plusieurs types de tests : étude de la fermentation de divers glucides, auxanogramme, recherche directe d'une enzyme. Chaque tubule contient un substrat différent sur lequel le micro-organisme considéré va réagir. Ils sont remplis d'une suspension bactérienne calibrée (de densité différente selon la galerie). Pour les substrats dont le sigle est encadré, la cupule doit aussi être remplie de manière à créer un ménisque. Pour les substrats dont le sigle est souligné, la cupule doit être remplie d'huile de paraffine soit pour créer l'anaérobiose (absence d'oxygène), soit pour maintenir en solution les ions volatils produits par la réaction et ainsi assurer le virage de l'indicateur coloré de pH.
Les creux du support de la galerie doivent être remplis d'eau pour former une chambre humide, puis la galerie est posée dans le support et le couvercle par dessus. L'ensemble est incubé à une température adaptée pendant 24 à 48h.
Après addition des réactifs nécessaires à la révélation de différents tests, la galerie est lue conformément aux indications du fabricant et codée. Pour cela, les tests sont groupés par trois successivement de gauche à droite, les derniers triplets pouvant inclure des caractères bactériens comme la morphologie, le Gram, la mobilité, l'oxydase, la catalase, etc. qui ne sont étudiés dans la galerie mais qui sont indispensables à son interprétation. Les tests négatifs sont toujours codés 0 alors que le code affecté aux tests positifs varie selon la position du test dans le triplet : 1 pour le premier test, 2 pour le second, 4 pour le troisième. Les 3 résultats du triplet sont additionnés (il existe seulement huit possibilités pour la somme d'un triplet : 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7). Les sommes de chaque triplet lues de gauche à droite forment un code d'au moins 7 chiffres qui correspond au profil biochimique du micro-organisme étudié. La comparaison de ce code à ceux référencés dans la base de données gérée par Biomérieux permet en général d'identifier ce micro-organisme. Si le code numérique obtenu ne figure pas dans cette base de données, il peut s'agir d'un profil ou d'un micro-organisme non référencé, un problème technique (inoculum non respecté, paraffine oubliée, réactifs périmés, etc.) ou une mutation lors du développement bactérien.

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