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TD 5 de Microbiologie Oran IGMO : Les tests biochimiques d段dentification

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MessageSujet: TD 5 de Microbiologie Oran IGMO : Les tests biochimiques d段dentification Dim 1 Mar 2015 - 20:22

TD 5 de Microbiologie Oran IGMO : Les tests biochimiques d段dentification

Par Messaoui Naima

Identification biochimique:
L'identification biochimique est un examen qui permet d'identifier une bact駻ie en s'appuyant sur ces caract鑽es biochimiques, voici les caract鑽es biochimiques qu弛n cherche souvent chez les bact駻ies:
A-l帝tude des enzymes respiratoires terminales
A1- Recherche de l弛xydase
A2- Recherche de la catalase
B-Etude des caract鑽es biochimiques
B1- Le m騁abolisme glucidique
B2- ノtude des diff駻entes voies fermentatives interm馘iaires
B2-1. R饌ction au rouge de m騁hyle
B-2. 2. R饌ction de Voges-Proskauer (Production d誕c騁one
B-2. 3. Production du gaz partir du glucose
B- 2. 4. Recherche deβ-galactosidase
B- 2. 5. M騁abolisme des compos駸 azot
B- 2. 5. 1. Recherche de nitrate r馘uctase
B- 2. 5. 2. Recherche de l置r饌se
B-2. 5. 3. M騁abolisme prot駟que
B-2. 5. 3. 1. Recherche des d馗arboxylases : Lysine d馗arboxylase (LDC), Ornithined馗arboxylase (ODC) et Arginine dihydrolase (ADH)
B-2. 5. 3. 2. Recherche du tryptophane d駸aminase (TDA)
B-2. 5. 3. 4. Production d段ndole
B-2. 6. M騁abolisme des mol馗ules larges
B-2. 6. 1. Recherche de l馗ithinase
B-2. 6. 2. Recherche de lipase
B-2. 6. 3. Recherche dα-amylases
B-2. 6. 4. Recherche des prot饌ses
B-2. 6. 4. 1. Recherche de la cas駟nase
B-2. 6. 4. 2. Recherche de la g駘atinase
B-2. 6. 5. Recherche de citrate perm饌se
B-2. 7. Autres tests
B-2. 7. 1. Utilisation du mannitol
B-2. 7. 2. Recherche d檀駑olysines
B-2. 7. 3. L誕ntibiogramme
B-2. 7. 4. Syst鑪es d段dentifications microbiennes commerciales : La galerie Api 20E B-2. 7. 5. Croissance sur milieu King (King A et King B)




A retenir
Test Oxydase = Test d'ONPG :
Ce test permet de rechercher la pr駸ence d'une enzyme intracellulaire -galactosidase (ONPG hydrolase) qui permet l'hydrolyse du lactose en glucose et galactose.



Une bact駻ie lactose- peut l'黎re pour 2 raisons :
Absence de -galactosidase.
Absence de -galactoside perm饌se
Le test ONPG permet de recherche directement la pr駸ence de -galactosidase en fournissant la bact駻ie un substrat de cette enzyme : L'orthonitroph駭yl- -D-galactopyranoside.
Test catalase:
La catalase est un enzyme ayant la propri騁 de d馗omposer le peroxyde d'hydrog鈩e (H2O2)avec d馮agement d'oxyg鈩e selon la r饌ction suivante :

2H2O2 catalase 2H2O + O2
Technique:
Sur une lame et l誕ide d置ne pipette Pasteur, on d駱ose une colonie bact駻ienne laquelle onajoute de l'eau oxyg駭馥 ( 10 volumes).
Lecture:
Catalase+ : effervescence.Catalase - : pas d'effervescence.


Milieu BCPL:
Le milieu BCP ou bouillon lactos au BCP est un milieu de culture non s駘ectif et non enrichi utilis en microbiologie pour l'identification de bact駻ies. C'est un milieu diff駻entiel, comportant un indicateur de pH, le pourpre de bromocr駸ol (BCP de l'anglais ォ bromocresol purple サ). Ce dernier donne une couleur pourpre au milieu, et passe au jaune si le lactose du milieu est utilis par les bact駻ies, par fermentation.
Lecture
Le pourpre de bromocr駸ol est pourpre en milieu basique ou neutre, et devient jaune lorsque le milieu devient acide et que le pH diminue.
Les bact駻ies "lactose +" utilisent le lactose pr駸ent dans le milieu comme source d'駭ergie. En d馮radant le lactose, les bact駻ies produisent de l'acide ce qui entrainera une acidification du milieu et donc le virage de l'indicateur color de pH (le pourpre de bromocr駸ol), qui en milieu acide est jaune.
les bact駻ies "lactose -" n'utilisent pas le lactose mais les peptones. En d馮radant les peptones les bact駻ies alcalinisent le milieu qui restera donc violet.
Milieu Kligler-Hajna
Le milieu de Kligler-Hajna est un milieu de culture permettant la recherche simultan馥 de :
L'utilisation du lactose ;
La fermentation du glucose ;
La production d'H2S ;
La production de gaz ;
La lysine d馗arboxylase.
La B-galactosidase pour les bact駻ies lactose - (test ONPG)
Ensemencement
La pente doit 黎re abondamment ensemenc馥 (stries serr馥s).
Le culot est ensemenc par simple piqre.
Incubation : 37 ーC pendant 18 24 h (ne pas d駱asser ce d駘ai) apr鑚 avoir d騅iss le bouchon partiellement ce qui permet les 馗hanges gazeux.
Pour pouvoir utiliser le lactose, une bact駻ie doit poss馘er deux enzymes (sch駑a ci-contre):

Il s'ensuit une s駻ie de r饌ctions de d馮radation du glucose (3) conduisant la production d'駭ergie E.
Le glucose inhibe la synth鑚e de ces deux enzymes. C'est ce que l'on appelle l'effet glucose. En effet, l'utilisation des glucides suit la loi de diauxie, l'utilisation du lactose n'aura lieu qu'apr鑚 駱uisement du glucose. Or, le glucose est en faible quantit par rapport au lactose et la pente est ensemenc馥 abondamment.
La pente et le culot doivent 黎re interpr騁駸 ind駱endamment.

Figure 1: R駸ultats de l'incubation du milieu de Kligler-Hajna.
Interpr騁ation de la pente

  • Dans un premier temps, les bact駻ies utilisent le glucose comme source de carbone et d'駭ergie ( cause de l'effet glucose). Cette utilisation s'accompagne de la production d'acides organiques d'o le virage du rouge au jaune du milieu (figure A).
  • Dans un second temps, du fait du d騅eloppement rapide (en a駻obiose) et de la faible concentration en glucose en moins de 24 heures, la totalit du glucose est d馮rad, il y a disparition de l'effet glucose. Puis, deux possibilit駸:

    • Si la bact駻ie est β-galactoside perm饌se + ET β-galactosidase +: les bact駻ies utilisent le lactose avec production d'acides organiques: le virage au jaune est confirm (figure B).
    • Si la bact駻ie est β-galactoside perm饌se + et β-galactosidase - OU β-galactoside perm饌se - et β-galactosidase -: les bact駻ies ne peuvent pas utiliser le lactose. Les bact駻ies utilisent alors comme source de carbone et d'駭ergie les peptones (qui ne sont d馮radables qu'en conditions a駻obies): le m騁abolisme protique lib鑽e des produits basiques (ammoniac, amines...) d'o une recoloration au rouge de la pente.



Ainsi:


Interpr騁ation du culot

  • Dans un premier temps, les bact駻ies fermentent le glucose avec production importante d'acides organiques ( cause de l'effet glucose)
  • Comme sur la pente, en moins de 24 heures, tout le glucose est ferment. Cependant, si les bact駻ies sont lactose -, l'utilisation des peptones avec une alcalinisation ne permet pas le revirage de l'indicateur de pH, le culot restera jaune en 24 h (figure D).
  • Si la bact駻ie n'est pas capable de fermenter le glucose, il n'y a pas production d'acides organiques, le culot reste rouge (figure C).

Ainsi:


Production de gaz
La production de gaz lors de l'utilisation des glucides est mise en 騅idence par le d馗ollement de la g駘ose et/ou des bulles dans la g駘ose. (On parle aussi de ォfragmentationサ de la g駘ose). S'il n'y a pas ces t駑oins de d馮agement gazeux, la bact駻ie est gaz
Production de sulfure d'hydrog鈩e
Elle a lieu partir de l'ion thiosulfate:
Le sulfure d'hydrog鈩e r饌git avec les ions fer III (Fe3+) du citrate de fer pour former un pr馗ipit de sulfure de fer noir. Ainsi:

  • Bact駻ies H2S +: pr馗ipit noir;
  • Bact駻ies H2S -: pas de pr馗ipit noir.






La galerie Api 20 E:

La galerie API 20E compote 20 microtubes contenant des substrats sous forme d駸hydrat馥, Les tests sont inocul駸 avec une suspension bact駻ienne qui reconstitue les milieux. Les r饌ctions produites pendant la p駻iode d'incubation se traduisent par des virages color駸 spontan馥s ou r騅駘駸 par l'addition de r饌ctifs
Une galerie API est un ensemble de petits tubes pr黎s l弾mploi permettant l'identification de micro-organismes par la r饌lisation rapide et facile de tests biochimiques miniaturis駸


Identification par galerie API Les galeries Api utilisent plusieurs types de tests : 騁ude de la fermentation de divers glucides, auxanogramme, recherche directe d'une enzyme. Chaque tubule contient un substrat diff駻ent sur lequel le micro-organisme consid駻 va r饌gir. Ils sont remplis d'une suspension bact駻ienne calibr馥 (de densit diff駻ente selon la galerie). Pour les substrats dont le sigle est encadr, la cupule doit aussi 黎re remplie de mani鑽e cr馥r un m駭isque. Pour les substrats dont le sigle est soulign, la cupule doit 黎re remplie d'huile de paraffine soit pour cr馥r l'ana駻obiose (absence d'oxyg鈩e), soit pour maintenir en solution les ions volatils produits par la r饌ction et ainsi assurer le virage de l'indicateur color de pH.
Les creux du support de la galerie doivent 黎re remplis d'eau pour former une chambre humide, puis la galerie est pos馥 dans le support et le couvercle par dessus. L'ensemble est incub une temp駻ature adapt馥 pendant 24 48h.
Apr鑚 addition des r饌ctifs n馗essaires la r騅駘ation de diff駻ents tests, la galerie est lue conform駑ent aux indications du fabricant et cod馥. Pour cela, les tests sont group駸 par trois successivement de gauche droite, les derniers triplets pouvant inclure des caract鑽es bact駻iens comme la morphologie, le Gram, la mobilit, l'oxydase, la catalase, etc. qui ne sont 騁udi駸 dans la galerie mais qui sont indispensables son interpr騁ation. Les tests n馮atifs sont toujours cod駸 0 alors que le code affect aux tests positifs varie selon la position du test dans le triplet : 1 pour le premier test, 2 pour le second, 4 pour le troisi鑪e. Les 3 r駸ultats du triplet sont additionn駸 (il existe seulement huit possibilit駸 pour la somme d'un triplet : 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7). Les sommes de chaque triplet lues de gauche droite forment un code d'au moins 7 chiffres qui correspond au profil biochimique du micro-organisme 騁udi. La comparaison de ce code ceux r馭駻enc駸 dans la base de donn馥s g駻馥 par Biom駻ieux permet en g駭駻al d'identifier ce micro-organisme. Si le code num駻ique obtenu ne figure pas dans cette base de donn馥s, il peut s'agir d'un profil ou d'un micro-organisme non r馭駻enc, un probl鑪e technique (inoculum non respect, paraffine oubli馥, r饌ctifs p駻im駸, etc.) ou une mutation lors du d騅eloppement bact駻ien.
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